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Hong Kong科技(science and澳门网站大全网址平台 technologyState of Qatar高校第一遍解析了TARP CT与MAGUK相剥离的积极分子机制

石云实验室的研究揭示了每个AMPA受体由两个GluA1和两个GluA2蛋白亚基构成,更进一步的研究表明是GluA1的信号肽决定了AMPA受体的空间构型,信号肽不仅抑制GluK1的突触定位,第二、GluK1信号肽抑制了其本身具有的突触后膜转运能力,解析了TARP CT与MAGUK相分离的分子机制,为了验证TARP/MAGUK相分离对于AMPA受体生理功能的作用,人的大脑中约含有100亿个神经元,谷氨酸受体在神经元中需要转运至细胞膜

9月6日《美国科学院院刊》在线发表南京大学模式动物研究所石云实验室的最新研究进展“GluA1
Signal Peptide Determines the Spatial Assembly of Heteromeric AMPA
Receptors”。南京大学的博士后何雪妍和博士生李燕军是论文的共同第一作者,石云教授为通讯作者。

2018年11月19日,南京大学模式动物研究所、南京大学生物医药国家重点实验室和鼓楼医院联合中心、南京大学脑研究院石云课题组在国际著名杂志《Nature
Communications》上在线发表题为“Signal peptide represses GluK1 surface
and synaptic trafficking through binding to amino-terminal
domain”的研究成果,揭示信号肽对于大脑神经细胞之间信号传递功能的调控作用。南京大学博士生段桂芳是该工作的第一作者,南京大学的石云教授和中国科学院昆明动物研究所的盛能印研究员为本文的共同通讯作者,共同作者里还有中国科学技术大学的金腾川博士和UCSF的Roger
Nicoll教授等。

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人的大脑中约含有100亿个神经元,它们通过神经突触这一个独特而又基本的结构实现信息传递交流和整合。突触前神经元释放的神经递质,进入突触间隙之后会与定位于突触后膜的神经递质受体相结合,引起突触后神经元活性变化,从而实现神经信息的跨细胞传递。这一过程的调控异常被认为是神经精神疾病发生的重要原因之一,也是相关疾病干预治疗的重要靶点。

大脑内的神经细胞之间通过微小的特化结构——突触进行信号的交流。当一个神经细胞将它编码的信号传给下级神经细胞时,会在突触中释放化学信号谷氨酸。谷氨酸结合到突触后膜上的谷氨酸受体从而将信号传递到下级神经细胞。突触后膜上的一种重要的谷氨酸受体被称为AMPA受体,主要由GluA1和GluA2两种不同的蛋白亚基组成。为了揭示这种异源AMPA受体的分子构成以及空间结构,研究者设计了一个巧妙的实验。他们以同源AMPA受体的晶体结构为模板,使用Cysteine
Crosslinking的技术来探究各个蛋白亚基之间的接触面,从而揭示异源AMPA受体的空间排列。石云实验室的研究揭示了每个AMPA受体由两个GluA1和两个GluA2蛋白亚基构成,并且有着固定的空间排列,称作1-2-1-2构型。

人的大脑是由约100亿个神经元组成,这些神经元通过突触这种特化细胞间连接结构进行信息交换。突触前神经元通过突触前膜释放神经递质,结合于突触后膜的神经递质受体,引起突触后神经元的电生理变化,从而实现神经信号的跨细胞传递。在大脑内,兴奋性的信号传递主要是由突触前膜释放的谷氨酸结合于突触后膜的谷氨酸受体来实现的。因此,谷氨酸受体在神经细胞内合成,转运并恰当地定位到突触后膜对于大脑正常行驶功能具有重要的意义。

2019年9月3日,香港科技大学的张明杰团队在Neuron杂志上发表文章Phase
Separation-Mediated TARP/MAGUK ComplexCondensation and AMPA Receptor
Synaptic Transmission,解析了TARP CT与MAGUK相分离的分子机制。

在大脑内,谷氨酸是主要的兴奋性神经递质传递,与其对应的谷氨酸受体在神经元突触部位的表达水平,则是突触信息传递的效率和神经网络活性重要决定因素之一。谷氨酸受体在神经元中需要转运至细胞膜,以及定位到突触后膜,这对于大脑行使正常生理功能过程至关重要。

在进一步探讨这种空间结构是由哪个结构域决定时,研究者发现了一个令人惊讶的结果:AMPA受体的空间排列是由“信号肽”序列决定的。当交换GluA1和GluA2的信号肽时,尽管成熟蛋白的氨基酸序列没有变化,GluA1和GluA2的空间位置会互相交换,从而形成2-1-2-1的空间排列方式,更进一步的研究表明是GluA1的信号肽决定了AMPA受体的空间构型。信号肽是位于蛋白肽链前端的20-40个氨基酸序列,一般会在蛋白质成熟之前被切掉。经典理论认为,蛋白质的初级结构决定高级结构。石云研究室的研究结果显然与这一理论不同。

通过与盛能印博士的合作,石云课题组在利用CA1椎体神经元来研究Kainate-型谷氨酸受体的突触功能时发现:在CA1神经元表达GluK2受体能够进入突触后膜,极大地增强突触后电流,而表达GluK1受体却不能进入突触后膜,不影响EPSCs(Sheng
et al., 2015; Sheng et al.,
2017)。为了解析KAR受体的突触定位机制,石云课题组依据GluK1和GluK2蛋白结构的相似性,构建和检测了一系列的嵌合型突变受体。他们意外发现GluK1的前导信号肽发挥着关键性调节作用。当GluK1的信号肽替换为GluK2信号肽时,GluK1受体成功定位到突触上,并且该GluK1受体能够10倍地增强突触后电流,其幅度与GluK2类似
。课题组人员推测,这个现象存在两种可能的机理,第一、GluK2的“超级”信号肽赋予了GluK1额外的突触转运能力。第二、GluK1信号肽抑制了其本身具有的突触后膜转运能力。为了区分这两种可能性,课题组人员设计了两个实验。第一个实验是将GluK1的信号肽换成GluA1的“弱”信号肽,因为过去的研究表明在CA1神经元表达GluA1时,并不能增强突触活性,结果在这个“弱”信号肽带领下,GluK1同样可以增强突触电流
(Fig. 1B,
E)。第二个实验更直接,将GluK1的信号肽和GluK1共同表达在同一个神经元中,结果GluK1的突触增强效应被完全抑制
(Fig.
1C,D,F),说明GluK1的信号肽对于GluK1的突触定位具有反式抑制作用。进一步的解析发现GluK1的信号肽和氨基端结构域共同发挥抑制作用,缺一不可。生物化学实验进一步证明GluK1的信号肽可以和GluK1的ATD相互结合。同时,课题组研究人员也发现,信号肽不仅抑制GluK1的突触定位,也抑制了上膜转运。所有这些研究结果表明,GluK1受体的信号肽能够作为一个非常规配体,结合于其ATD结构域,行驶调节GluK1受体胞内转运和突触定位的功能

研究人员首先纯化出TARP家族成员整个C端胞内段的蛋白。令人惊讶的是,TARP
CT呈现出远高于PBM的与MAGUK家族的亲和强度。更有意思的是,TARP
CT与MAGUK全长蛋白能在近似生理条件和蛋白浓度下发生典型的相分离现象。与MAGUK蛋白结合后,TARP
CT蛋白会自发地富集在浓缩相中,且该过程并不依赖磷脂膜的分隔。张明杰团队进一步综合运用生化和核磁研究手段,解析出TARP
CT与MAGUK相分离的分子机制。除去PBM与PDZ结构域的相互作用以外,TARP
CT上有一段高度保守的Arg motif,能与MAGUK
PDZ1上一个同样保守的负电表面相互作用。这种TARP-MAGUK之间多价态的相互作用促进了相分离的产生。将这些序列突变后,两个蛋白之间的亲和力与相分离能力都相应地减弱。

KAR型谷氨酸受体在中枢神经系统中发挥重要调节功能,与多种神经精神疾病的发生发展密切相关。中国科学院昆明动物研究所研究员盛能印长期从事KAR受体相关研究,并在前期工作中取得一系列研究成果(Elife
2015;JBC 2017;PNAS
2017)。发现其关键性亚基成员GluK1和GluK2虽然同源性很好,但在神经元中的转运活性是完全不同的,GluK1缺乏自主转运能力,而GluK2具有自主转运能力。此外,这两种受体转运能力的差异是由它们自身细胞外氨基端功能结构域所决定的。

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传统的观点认为前导信号肽只是编码新合成蛋白的胞内定位信号,它将新合成的肽链导入内质网,从而最终进入分泌途径或者定位到细胞膜。一般来说,信号肽把肽链导入内质网就完成了其功能,在内质网膜上被信号肽酶切割下来,和后续的转运没有关系。本论文发现了GluK1的信号肽除了指导GluK1进入内质网的经典功能之外,还有调节后续转运的全新功能,这也是膜蛋白的信号肽研究方面的新发现。值得一提的是,本研究是在石云教授参与的一系列研究工作的基础上做出的(Granger
et al., 2013; Sheng et al., 2018; Sheng et al., 2015; Sheng et al.,
2017)。石云教授的这个成果也和他的团队在2016年的发现(He et al.,
2016)遥相呼应。在2016年的论文中,课题组研究人员发现AMPA型谷氨酸受体GluA1/A2的空间排列是由GluA1的信号肽决定的。因此,石云教授的研究表明谷氨酸受体的信号肽在受体的合成和转运中的作用远超其传统功能,而谷氨酸受体的合成和转运也远比预想的要复杂。这些工作揭开了谷氨酸受体胞内复杂合成、装配和转运机制的冰山一角。

考虑到TARP本身是一个跨膜蛋白,为了更好地模拟TARP
CT在生理状态下的构象以及与磷脂膜之间可能的相互作用,该团队进一步生化重塑出带负电的磷脂双分子层结构。在该重塑结构中,TARP
CT的运动被限定在二维磷脂膜上,且磷脂膜中的PIP2负电基团会与TARP CT上的Arg
motif结合,减缓TARP
CT的流动。在该体系下,MAGUK和其它的PSD支架蛋白复合物仍能引发TARP
CT产生相分离,意味着跨膜蛋白胞内段与胞浆蛋白的多价态相互作用能促进跨膜蛋白在二维层面的相分离。

昆明动物所盛能印课题组与南京大学模式动物研究所石云课题组就这一科学问题展开深入合作,揭示了信号肽调控谷氨酸受体在神经细胞中转运活性的非经典功能,研究成果以Signal
peptide represses GluK1 surface and synaptic trafficking through binding
to amino-terminal domain

为题,于11月19日在线发表在《自然-通讯》(Nature Communications)上。

图一、信号肽对AMPA受体空间结构的影响。

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目前,大多数生物大分子相分离的研究局限于体外系统,或者简单的细胞系系统。如何在复杂的生理条件下验证相分离的生理学功能将是制约相分离领域发展的瓶颈。为了验证TARP/MAGUK相分离对于AMPA受体生理功能的作用,张明杰团队和UCSF的Roger
Nicoll团队展开合作。哺乳动物的大脑中有多个AMPA受体家族成员和多个TARP家族成员。不同的家族成员间能相互组合。因此,简单的过表达或者单一成员的基因敲除无法提供干净的遗传背景。该研究团队首先特定地敲除海马脑区中最主要的AMPA受体成员,同时表达共价连接的GluA1-TARPγ-8.
这样,海马神经细胞中多样化的AMPAR-TARP组合被归一为GluA1-TARPγ-8组合。接着团队在TARPγ-8的胞内区域引入一系列体外实验中验证过的突变。电生理研究发现,引入突变后,AMPA受体的EPSC相应地变弱了,但其本身的膜表达能力没有变化。这意味着AMPA受体的生成过程没有缺陷,但其PSD定位能力变弱了。而突变并不改变NMDA受体的EPSC,验证了TARP对AMPA受体PSD定位的特异性调节。

为了解析KAR受体的转运调控机制,依据GluK1和GluK2蛋白结构的相似性,研究人员构建一系列嵌合型突变受体,利用电生理膜片钳技术,在海马培养脑片的兴奋性CA1神经元中分析这些KAR突变受体的突触传递活性。在研究过程中,他们意外发现GluK1的信号肽发挥着关键性调控作用。当将GluK1受体的信号肽替换为GluK2信号肽时,GluK1受体则成功定位于突触后膜,并且该GluK1突变受体能够成倍地增强突触后电流大小,其幅度与野生型GluK2类似。研究人员推测,该现象存在两种可能性:第一,GluK2的“超级”信号肽赋予了GluK1额外的突触转运能力;第二,GluK1信号抑制了其本身所具备的突触后膜转运能力。为了区分这两种可能性,他们首先利用GluA1受体的“弱”信号肽,因为有研究表明在神经元中表达GluA1并不能增强突触活性,结果发现所构建的GluK1受体同样可以增强突触电流大小。更为直接的实验证据是,当将GluK1的信号肽和GluK1共同表达在同一个神经元中时,GluK1受体的增强突触活性的能力则被完全抑制,表明GluK1的信号肽对于GluK1的突触定位具有反式抑制作用。

石云实验室的研究结果不仅解析了脑内一种重要谷氨酸受体的分子结构,而且揭示了信号肽的一个全新功能。那么信号肽是如何决定蛋白质的空间结构呢?该结果为未来的研究提出了新的问题和挑战。

图一

图:通过相变锚定及富集AMPA受体于神经细胞突触后致密区

有研究表明,在某些GPCR受体中,信号肽不被切割以发挥调控作用。因此,研究人员通过构建不同的带有分子标签的受体突变体,通过生物化学分析,发现在成熟的GluK1和GluK2受体中,其信号肽均被有效切割。进一步的解析发现,GluK1的信号肽和氨基端结构域有着协同效应以发挥抑制作用,缺一不可。若将GluK1的ATD替换为GluK2的对应序列,同样可以解除GluK1信号肽的抑制转运功能。生物化学实验进一步证明GluK1的信号肽是通过与GluK1的ATD直接相互作用,以形成抑制性复合物,该作用机制也在GluK1细胞膜转运过程中发挥作用。因此,该研究发现,GluK1受体的信号肽能够作为非常规配体,与其ATD结构域相互作用,从而调节GluK1受体胞内转运和突触定位过程。

(模式动物研究所 科学技术处)

石云课题组的研究获得科技部、国家自然基金委、教育部中央高校基金和江苏省科技厅自然基金项目的支持。

该项关于TARP/MAGUK相互作用和相分离的研究,综合运用了生物化学,结构生物学和电生理等多领域的研究手段,不仅对我们了解兴奋性突触的组织和调控有重要的指导意义,也将相分离的研究引申至跨膜蛋白二维层面的区域化组织机制。

传统观点认为,信号肽只是新合成蛋白的胞内定位的编码信号,它只是负责将新合成的肽链导入内质网,以使其进入分泌途径或者定位到细胞膜。一般来说,在内质网膜上,信号肽会被信号肽酶从成熟的蛋白质中切割下来,其即完成了其生物学功能。然而,该项研究工作发现GluK1的信号肽除了指导GluK1进入内质网的经典功能之外,释放的信号肽仍与受体相互结合,发挥调控其后续转运活性的非经典作用,这也是在谷氨酸受体的信号肽研究方面的首次发现。该研究也揭示了谷氨酸受体突触转运的新调控机制,为进一步阐明兴奋性突触传递活性调控机制及相关神经精神疾病的发病机理提供了重要理论基础。

(模式动物研究所 科学技术处)

据悉,该文章的一作是香港科大博后曾梦龙,UCSF的博后Javier Diaz
Alonso是该文章的共同一作。值得一提的是曾梦龙博士也是张明杰团队在2016、2018年关于突触相变两篇Cell文章的一作。

南京大学博士生段桂芳为文章的第一作者,盛能印和石云为文章的共同通讯作者。该研究受到国家基金委、中科院战略先导B专项(动物复杂性状的进化解析与调控)、中科院百人计划、科技部、遗传资源与国家重点实验室开放课题等的资助。

研究背景

文章链接

大脑,作为我们身体中最复杂的器官,拥有一个极其复杂的神经细胞网络。在这个网络中,每一个神经细胞通过成千上万个神经突触与其它的神经细胞进行信息交流。交流的方式主要包括电信号和化学信号两类。以大脑中最主要的一类兴奋性神经突触为例,在电信号的驱动下,突触前膜释放出兴奋性神经递质——谷氨酸。谷氨酸通过扩散的方式越过突触间隙,结合并激活位于突触后膜的谷氨酸受体,并进一步导致突触后膜的去极化。在这个过程中,谷氨酸化学信号通过将突触前膜的电信号转化成为突触后膜的电信号,完成了两个神经细胞之间的信息交流。

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大脑中最主要的离子型谷氨酸受体有两类:AMPA受体和NMDA受体。其中,AMPA受体介导了大脑中绝大多数突触后膜的快速去极化。然而,与它的功能看似矛盾的地方在于,AMPA受体与谷氨酸的亲和力并不强,远弱于NMDA受体与谷氨酸的亲和力。这意味着如果AMPA受体不能被精确地锚定在谷氨酸释放位点附近,则难以被谷氨酸高效地激活。那么,什么样的分子机制能确保AMPA受体的精准定位与激活呢?

GluK1受体信号肽通过反式作用抑制其突触转运活性。脑片神经电生理膜片钳分析:将GluK1受体信号肽替换为具有突触定位活性的谷氨酸受体(GluK2或GluA1)信号肽后,嵌合型受体突触传递活性;GluK1信号肽反式抑制作用。GluK1信号肽作用机制模式图:其切割释放后与受体细胞外氨基端关键结构域形成抑制复合物。

在被突触前神经细胞释放之前,谷氨酸储存在位于轴突末梢的突触小泡中。突触前膜上有一块高度特异化的区域被称之为active
zone。突触小泡通过与active
zone融合,将储存的谷氨酸释放至突触间隙中。与active
zone相对应的是,突触后膜上也有一块高度特异化的区域,称之为突触后致密区,负责大脑信号的处理和传递。Active
zone 和PSD面对面地排列在突触间隙两侧。从active
zone释放的谷氨酸在跨越突触间隙后首先抵达的区域即是PSD。可以想像,如果AMPA受体能被高度富集在PSD中,则能更大程度地确保其被谷氨酸激活。

PSD中最大量的一类支架蛋白是以PSD-95为代表的MAGUK家族成员。以往的实验表明,在神经细胞中过表达PSD-95,会增强AMPA受体介导的突触电信号传递。而在神经细胞中同时knock
down多个MAGUK家族成员,则会减弱AMPA受体的PSD定位和突触电信号传递。这一系列的实验都指向AMPA受体与MAGUK家族之间高度特异的相互作用。然而,有意思的是,AMPA受体的PSD定位并不取决于它自身与MAGUK的直接相互作用,而是由一类名为TARP的辅助型亚基介导完成的。TARP是一个四次跨膜蛋白,一方面通过其跨膜区域和胞外区域与AMPA受体绑定,另一方面通过其胞内区域与MAGUK结合。我们过去对于这一结合模式的认识仅限于TARP的C末端有一个PDZ结合序列,能与MAGUK蛋白上的PDZ结构域弱相互结合。但考虑到细胞内有近三百个PDZ结构域,这种结合模式显然不能解释TARP与MAGUK之间高度特异的相互作用,也不能解释如何将AMPA受体高度富集在PSD中。

香港科技大学的张明杰教授团队长期以来致力于突触结构与功能的研究。在传统的结构生物学和生物化学的基础上,张明杰团队于2016年在Cell杂志上发表文章,首次提出突触蛋白的相分离可能是PSD形成和可塑性调节的分子机制。在此基础上,两年后的2018年,张明杰团队再次在Cell杂志上发表文章。通过相分离的方式,该团队在体外系统中首次用纯化的突触蛋白重塑出类似PSD的结构。该结构能重现出PSD在神经细胞内的一系列关键功能。

在过去的几年中,生命科学领域涌现出一系列关于生物大分子相分离的研究。生物大分子的相分离被认为可能是细胞内无膜分隔型区域化组织的分子基础。目前,绝大部分的相分离研究都集中在细胞胞浆大分子或者细胞核内大分子的相分离,即三维空间内的生物大分子如何通过相分离聚集在无膜包裹的亚细胞结构中。值得注意的是,细胞中有大量的功能性蛋白是嵌合在磷脂双分子层中的跨膜蛋白。这些跨膜蛋白能在二维的磷脂膜内自由流动,但为了完成其特定的生物学功能,它们需要被锚定到特定的区域。以AMPA受体为例,为了与突触前膜释放的谷氨酸结合,AMPA受体需要被富集到PSD区域,而不能在整个神经细胞的细胞膜中无差别地分布。那么,这种跨膜蛋白二维层面的富集是否也依赖于生物大分子的相分离呢?

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